一、目的

掌握质粒的常用提取方法及其定量测定。
 
二、原理
质粒(Plasmid)是游离于细胞染色体之外的具有自行复制子的双链闭环的DNA分子，其大小范围从1kb至200kb以上不等。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恆定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状，根据质粒赋予细胞的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细胞的根据。质粒的质粒分为两类：原核细胞表达质粒和真核细胞表达质粒。
分子生物学实验中用于重组DNA技术的质粒常常为经过改造的细菌质粒，它通常具有以下特征：①多克隆位点（MCS）：为一些限制性内切酶的单一识别位点，可将外源DNA在这些位点上插入构成重组体，而不破坏质粒的生存能力及特性；②选择标志：常为抗药性基因，如抗卡那霉素基因（Ken⁺）。这是一种显性基因，其产物是一种酶，能够分解相应的药物（如卡那霉素）。因此，被这种质粒转化的细菌便能够在含有相应药物的培养基中繁殖，据此可判断细菌转化实验是否成功；③复制子（Promoter）：是一段具有特殊结构的DNA序列，能启动DNA分子的自行复制，此外还带有一些编码质粒复制过程中必须的RNA和蛋白质的基因。
质粒提取的方法有多种：碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。本实验采用碱裂解法，即在碱及SDS作用下菌体破碎，质粒释出，而细菌染色体仍附在细胞膜上，可通过离心除去。
 
三、试剂
2M  Glucose          0.25ml
1M  Tris-HCl (pH 8.0)  0.25ml
0.1M EDTA (pH 8.0)    1.00ml
灭菌水               8.50ml，
临用现配。   
2. 0.2N NaOH/1%SDS：
        灭菌水                7.00ml
       1N  NaOH            2.00ml
       10%  SDS            1.00ml
3. 氯仿（Chloroform）(AR)
4. 异丙醇（Isopropanol）(AR)
5. 70%冰乙醇（Ethanol）(AR)
6. 4M NaCl：116.9gNaCl溶于300ml蒸馏水中，再加蒸馏水至500ml。室温保存。
7.  13%PEG8000：13g PEG8000溶于60ml蒸馏水中，再加蒸馏水至100ml，然后用0.22 μm滤器除菌过滤，4 ^oC保存。
8. 3M KAc（pH4.8）：29.4g KAc，加少量蒸馏水溶解，用乙酸将pH调至4.8（约50ml），再加蒸馏水至100ml，室温保存。

9．去离子水
10．10mg/ml Rnase A：100mg DNase-free Rnase A加10ml TE缓冲液，加热100 ^oC 10min以灭活DNase，然后逐渐冷却。-20 ^oC保存。
11．1M Tris-HCl（pH8.0）：蒸馏水600ml；Tris 60.6g；HCl 15ml；用HCl将pH调至8.0，再加蒸馏水至500ml。
12．2M Tris-HCl（pH7.4）：蒸馏水300ml；Tris 121.2g；HCl 35ml；用HCl将pH调至7.4，再加蒸馏水至500ml。
13．2M 葡萄糖：36g葡萄糖，溶于60ml蒸馏水中，再加蒸馏水至100ml，然后用0.22 μm滤器除菌过滤，-20 ^oC保存。
14．0.1M EDTA:  18.7g EDTA-Na₂-2H₂O，溶于300ml蒸馏水中，加入1 N NaOH约40ml，继续将pH调至8.0，加蒸馏水至500ml, 室温保存。
15．1N NaOH：40g NaOH，溶于60ml蒸馏水中，再加蒸馏水至1000ml，室温保存。
16．10%SDS：10g SDS，溶于60ml蒸馏水中，再加蒸馏水至100ml，室温保存。
17．TE缓冲液：10mM Tris（pH7.4）0.5ml；0. 1Mm EDTA（pH8.0）0.1ml；加蒸馏水至10ml。
18．50mg/ml卡那霉素
 
四、实验仪器
1.      37℃水浴箱  (北京市医疗设备厂 型号：BS2型)
2.      高速离心机  (珠海黑马医学仪器有限公司 型号：TGL-16H型)
3.      紫外分光光度计    (上海第三分析仪器厂 型号：UV-754型)
4.      4℃低温离心机    (珠海黑马医学仪器有限公司 型号：TGL-18R型)
5.      离心管（1.5ml和0.5ml）
6.      微量加样器吸头
7.      微量加样器（1—10μl，1—100μl，200μl，1000μl）
8.      冰盒
 
五、实验步骤
1．将含pBKcmv-hMLCK1的XL1-blue大肠杆菌接种到含有卡那霉素的固体培养基上（每毫升培养基加1μl 50mg/ml卡那霉素），37 ^oC孵育24h；
2．用灭菌牙签挑选一单个菌落接种到3.0mlLB培养基中(含3μl卡那霉素)，37 ^oC振荡培养过夜；
3．3000rpm离心10min；轻轻倾去上清液，离心管倒置滤纸上片刻；
4．将沉淀重悬于200μl GTE缓冲液中，转移至1.5ml 离心管中；
5．加300μl NaOH/SDS液，颠倒混匀，置冰上5min；
6．加300μl 3M KAc（pH4.8），混匀，置冰上5min；
7．14000rpm，离心10min，将上清液移入另一1.5ml离心管中；
8．上清液中加1.6μl 10mg/ml Rnase A，37 ^oC孵育20min；
9．加氯仿400μl，混匀30sec，14000rpm离心1min，取上清液0.7ml置另一1.5ml离心管中，再用400μl氯仿提取一次；
10．取上清液0.6ml加入等体积异丙醇，混匀，14000rpm离心10min，倾去上清液，离心管倒置滤纸上片刻；
11．沿管壁慢慢加入0.5ml预冷70%乙醇，洗涤沉淀，14000rpm离心5min，倾去上清液，离心管倒置滤纸上片刻，真空干燥5min或室温干燥；
12．用32μl灭菌水溶解沉淀物，加8μl 4M NaCl和40μl 13%PEG8000，混匀，置冰上20min；
13．14000rpm，4 ^oC离心15min，弃去上清液；
14．沿管壁慢慢加入0.5ml预冷70%乙醇，洗涤沉淀，14000rpm离心5min，倾去上清液，离心管倒置滤纸上片刻，真空干燥5min或室温干燥；
15．用20μl灭菌水溶解DNA；
16．取5μl DNA溶液用495μl灭菌水稀释，用UV分光光度计比色，读取A₂₆₀和A₂₈₀吸光度值，计算出A₂₆₀ /A₂₈₀   比值及质粒DNA浓度。
 
六、结果   
1． 按下列公式计算DNA浓度： 
 
    质粒DNA浓度（μg/μl）= A₂₆₀×稀释度/20= A₂₆₀×5 
                                                                                                                                                                
 2．质粒DNA的纯度和含量测定结果：
          A260＝
          A280＝
          A₂₆₀／A₂₈₀＝
          质粒DNA含量＝        μg/μl；
 
3．若A₂₆₀ /A₂₈₀比值在⒈8---⒉0之间，说明质粒DNA纯度高，
若A₂₆₀ /A₂₈₀＜⒈8，则说明提取的质粒DNA中，还有蛋白质没有除去；
若A₂₆₀ /A₂₈₀＞⒉0，则说明提取的质粒DNA中，还有RNA没有除去。
 
七﹑注意事项 
1．NaOH/SDS液需现用现配，且这一步反应需要充分混匀，使细胞裂解。
2．整个过程动作轻柔，防止提取的DNA链断开。

    ⒈ GTE缓冲液：

3．碱裂解第11、14步离心后要缓慢倒上清液，防止将管底的DNA沉淀一起倒出。