组织和白细胞中基因组DNA的提取
2015-6-28 9:45:34 点击：
一、 目的
掌握真核生物基因组DNA的提取方法。
二、 原理
高产量和高纯度的真核生物DNA分离技术是进行PCR、Southern杂交、DNA文库构建，及许多其它分子生物学研究的前提条件。真核生物基因组DNA位于细胞核内，与细胞核蛋白结合在一起。要提取真核细胞基因组DNA，必须去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类以及RNA等生物大分子。采用组织匀浆法破碎细胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化细胞的蛋白质。该方法虽然传统、简单，但却行之有效；不仅实验操作具有相当大的灵活性，而且不需昂贵的仪器设备。其中SDS能破坏核膜使DNA释放入水溶液，还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白质，并与蛋白质结合成复合物从而使蛋白质变性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金属离子，抑制DNA酶对DNA的降解作用。这样大分子DNA在乙醇中便以絮状物析出，离心沉淀后再用70%的乙醇洗涤除盐，干燥后溶于TE或双蒸水中。以此法制备的DNA大小一般为40～150kb。
三、 仪器材料
（一）仪器
1．恒温水浴锅（北京医疗设备厂，型号：BS2-I）
2．高速离心机（Hema，型号：TGL-16H）
3．冷冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司，型号：TGL-18R）
4．-20℃冰箱（海尔集团青岛电冰柜总厂 型号：BD-198S）
5．液氮罐（成都液氮容器厂，型号：YDS-35-125）
6．匀浆器
7．自动制冰机 (意大利SCOTSMAN公司 型号：AF-10)
（二）材料
1. 动物或人的组织标本
2. 人的血液标本
四、 试剂
1. DNA抽提缓冲液：
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2．液氮
3．蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作浓度100－200μg/ml。
4．平衡酚
5．氯仿
6．3M乙酸钠（pH4.8）：称取40.81g三水乙酸钠溶于80.0ml水中，用冰乙酸调节pH值至4.8，定容至100ml。
7．预冷的100%乙醇
8．预冷的70%乙醇
9. 预冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 组织细胞基因组DNA的提取
1. 取新鲜组织或冰冻组织块0.3-0.5cm3，尽量剪碎，加DNA抽提缓冲液400μl，在组织匀浆器中匀浆至不见组织块，转入1.5ml Ep管中，用100μl DNA抽提缓冲液冲洗匀浆器，冲洗液一并转入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至终浓度100-200μg/ml，混匀后放于37℃水浴5-12h，中间振摇数次。
3. 加500μl（等体积）平衡酚，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min，小心取出上层水相450μl，移入一新的Ep管，必要时重复抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min。
5. 小心取出上层水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷冻离心15min，轻轻弃去上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
7. 待沉淀干燥后，加适量的TE或双蒸水溶解，-20℃或4℃保存备用。
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl双蒸水中，混匀，测定其在260nm和280nm处的吸光度值。
DNA含量（mg/ml）=A260×5
（二）白细胞基因组DNA的提取
1. 收集5～10ml抗凝血，3000rpm离心10min，弃去上层淡黄色的血浆，小心吸取白细胞层。
2. 用双蒸水洗涤白细胞，使混杂的红细胞溶血，3000rpm×10min离心数次，以去除红细胞。
3. 收集白细胞沉淀，以适量双蒸水或PBS重悬白细胞，移入1.5ml的离心管中，每管0.25ml。
4. 加入等体积（0.25ml）的2×DNA抽提缓冲液，加蛋白酶K至终浓度100～200μg/ml，混匀后放于37℃水浴2～5h。
5. 加500μl（等体积）平衡酚，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min，小心取出上层水相450μl，移入一新的1.5ml Ep管，必要时重复抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min。
7. 小心取出上层水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷冻离心15min，轻轻弃去上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
9. 待沉淀干燥后，加适量的TE或双蒸水溶解，-20℃或4℃保存备用。
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl双蒸水中，混匀，测定其在260nm和280nm处的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260×稀释倍数/20=A260×5
六、结果
0.5%的琼脂糖凝胶（加入溴化乙锭至终浓度0.5μg/ml）电泳，即可见荧光显色的DNA条带。
七、注意事项
1. 组织块取材应尽量新鲜，应在尽可能剪碎后进行匀浆。所用匀浆器须配套适中，过大过小均不利于研磨组织块。
2. 蛋白酶K应尽量新鲜配制，在正式使用前应做预试验以明确其活性。
3. 在进行平衡酚、氯仿抽提时，应尽量避免吸取蛋白质，以免影响DNA的纯度。
4. DNA沉淀不能抽得太干，否则极难溶解。稍加热可促进DNA的溶解。
掌握真核生物基因组DNA的提取方法。
二、 原理
高产量和高纯度的真核生物DNA分离技术是进行PCR、Southern杂交、DNA文库构建，及许多其它分子生物学研究的前提条件。真核生物基因组DNA位于细胞核内，与细胞核蛋白结合在一起。要提取真核细胞基因组DNA，必须去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类以及RNA等生物大分子。采用组织匀浆法破碎细胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化细胞的蛋白质。该方法虽然传统、简单，但却行之有效；不仅实验操作具有相当大的灵活性，而且不需昂贵的仪器设备。其中SDS能破坏核膜使DNA释放入水溶液，还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白质，并与蛋白质结合成复合物从而使蛋白质变性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金属离子，抑制DNA酶对DNA的降解作用。这样大分子DNA在乙醇中便以絮状物析出，离心沉淀后再用70%的乙醇洗涤除盐，干燥后溶于TE或双蒸水中。以此法制备的DNA大小一般为40～150kb。
三、 仪器材料
（一）仪器
1．恒温水浴锅（北京医疗设备厂，型号：BS2-I）
2．高速离心机（Hema，型号：TGL-16H）
3．冷冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司，型号：TGL-18R）
4．-20℃冰箱（海尔集团青岛电冰柜总厂 型号：BD-198S）
5．液氮罐（成都液氮容器厂，型号：YDS-35-125）
6．匀浆器
7．自动制冰机 (意大利SCOTSMAN公司 型号：AF-10)
（二）材料
1. 动物或人的组织标本
2. 人的血液标本
四、 试剂
1. DNA抽提缓冲液：
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2．液氮
3．蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作浓度100－200μg/ml。
4．平衡酚
5．氯仿
6．3M乙酸钠（pH4.8）：称取40.81g三水乙酸钠溶于80.0ml水中，用冰乙酸调节pH值至4.8，定容至100ml。
7．预冷的100%乙醇
8．预冷的70%乙醇
9. 预冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 组织细胞基因组DNA的提取
1. 取新鲜组织或冰冻组织块0.3-0.5cm3，尽量剪碎，加DNA抽提缓冲液400μl，在组织匀浆器中匀浆至不见组织块，转入1.5ml Ep管中，用100μl DNA抽提缓冲液冲洗匀浆器，冲洗液一并转入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至终浓度100-200μg/ml，混匀后放于37℃水浴5-12h，中间振摇数次。
3. 加500μl（等体积）平衡酚，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min，小心取出上层水相450μl，移入一新的Ep管，必要时重复抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min。
5. 小心取出上层水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷冻离心15min，轻轻弃去上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
7. 待沉淀干燥后，加适量的TE或双蒸水溶解，-20℃或4℃保存备用。
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl双蒸水中，混匀，测定其在260nm和280nm处的吸光度值。
DNA含量（mg/ml）=A260×5
（二）白细胞基因组DNA的提取
1. 收集5～10ml抗凝血，3000rpm离心10min，弃去上层淡黄色的血浆，小心吸取白细胞层。
2. 用双蒸水洗涤白细胞，使混杂的红细胞溶血，3000rpm×10min离心数次，以去除红细胞。
3. 收集白细胞沉淀，以适量双蒸水或PBS重悬白细胞，移入1.5ml的离心管中，每管0.25ml。
4. 加入等体积（0.25ml）的2×DNA抽提缓冲液，加蛋白酶K至终浓度100～200μg/ml，混匀后放于37℃水浴2～5h。
5. 加500μl（等体积）平衡酚，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min，小心取出上层水相450μl，移入一新的1.5ml Ep管，必要时重复抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min。
7. 小心取出上层水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷冻离心15min，轻轻弃去上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
9. 待沉淀干燥后，加适量的TE或双蒸水溶解，-20℃或4℃保存备用。
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl双蒸水中，混匀，测定其在260nm和280nm处的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260×稀释倍数/20=A260×5
六、结果
0.5%的琼脂糖凝胶（加入溴化乙锭至终浓度0.5μg/ml）电泳，即可见荧光显色的DNA条带。
七、注意事项
1. 组织块取材应尽量新鲜，应在尽可能剪碎后进行匀浆。所用匀浆器须配套适中，过大过小均不利于研磨组织块。
2. 蛋白酶K应尽量新鲜配制，在正式使用前应做预试验以明确其活性。
3. 在进行平衡酚、氯仿抽提时，应尽量避免吸取蛋白质，以免影响DNA的纯度。
4. DNA沉淀不能抽得太干，否则极难溶解。稍加热可促进DNA的溶解。
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